Grundlagenforschung Ersatz zu Tierversuchen...
Funktionelles Screening von Neuropharmaka mit neuronalen Zellkulturen
"Das Gehirn ist dynamisch in zelluläre Grundgesamtheiten organisiert,
... die die funktionellen Einheiten darstellen."
(GM Edelmann, 1987)
Mikroelektroden-Array-Neurochip
Aufzeichnungen von zellulärer elektrischer Aktivität werden meistens in Kultur mit Glasmikroelektroden einschließlich Salzlösung durchgeführt. Diese Elektroden werden mit einem Mikromanipulator intra- bzw. extrazellulär an der Zellmembran positioniert und können dann die Aktionspotenziale einer aktiven Zelle aufzeichnen.
Bei dieser Methode besteht die Gefahr, dass die Zellmembran beschädigt
und die ganze Zelle bzw. das ganze Netzwerk zerstört wird. Darüber
hinaus ist es schwierig und sehr zeitaufwendig, mit mehreren Glaselektroden
gleichzeitig in vivo oder in vitro zu arbeiten; dadurch ist die Anzahl
möglicher Messorte für simultane und langzeitige intrazelluläre
Ableitungen beschränkt.
Um diese Probleme zu vermeiden, werden ebenfalls spannungssensitive Farbstoffe
für die Messung der elektrischen Aktivität von Zellen verwendet;
dabei können andere Probleme wie Toxizität entstehen, die die
Messdauer einer Kultur üblicherweise auf 30-60 Minuten begrenzen.
Eine Alternative zu diesen Methoden ist die Verwendung von extrazellulären
Ableitelektroden, die sich außerhalb der Zelle befinden und das
extrazelluläre Spannungssignal aufnehmen. Seit den ersten Arbeiten
von Thomas et al. (1972) und den ersten erfolgreichen Aufzeichnungen von
neuronalen Aktionspotenzialen mit Mikroelektroden-Chips (Gross et al.,
1977) hat die stetige Entwicklung nun einen Punkt erreicht, an dem die
routinemäßige Beobachtung der internen Vorgänge von Netzwerken
bei Säugernervenzellen möglich ist.
Das Wachstum von Netzwerken auf Trägern mit dicht gepackten Mikroelektroden-Arrays
(MEA-Neurochips) liefert Zellkulturen, die langzeitige und kontinuierliche
Aufzeichnungen von einer Vielzahl von Messstellen in vitro und die Beobachtung
der Signalübertragung zwischen vielen Zellen ermöglichen. MEA-Neurochips
ermöglichen darüber hinaus nicht-invasive, langzeitige Aufzeichnungen
und Echtzeitanalysen von Aktionspotenzialmustern von bis zu 256 verschiedenen
Neuronen in Kurz- und Langzeituntersuchungen und sind gleichzeitig optisch
zugänglich für die Beobachtung der Netzwerkentwicklung.
Die MEA-Neurochips werden mit standardisierter, photolithographischer
Technik hergestellt. Kommerziell erhältliche Indium-Zinnoxid- (ITO)
oder goldbeschichtete Glasträger werden photolithographisch strukturiert,
mit Polysiloxan isoliert, und die Isolation wird über den Elektroden
wieder geöffnet. Die Elektroden werden galvanisch mit einer dünnen
Goldschicht belegt, um die Impedanz auf ca. 2-4 MOhm zu vermindern.
Die MEA-Neurochips werden für die Messungen in einer sterilen Dauerüberstand-Messkammer
eingebracht und bei 37°C, pH 7.4 und einem befeuchteten Luftstrom
mit 10% CO2 gehalten. Aufzeichnungen erfolgen mit dem Vielkanal-Aufzeichnungssystem
der Fa. Plexon Inc. (Dallas, USA), und einem PC-gesteuerten, 64-kanaligem
Verstärkersystem, welches Daten von Einzelneuronen liefert.
Spikeerkennung und -separation basieren auf einem Template-Matching-Algorithmus.
Die Amplitude der routinemäßig aufgezeichneten Signale liegt
üblicherweise zwischen 100-500µM, mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis.
Gehirnregion-spezifische neuronale Netzwerke in vitro
In den letzten drei Jahrzehnten stieg die Zahl der Studien mit neuronalen
Zellen, die erfolgreich in vitro als Monolayer-Kulturen wachsen, stetig.
In solchen Kulturen reifen die dissoziierten Zellen in einer Kulturschale
heran, bilden Ausläufer sowie Synapsen und erzeugen auf diese Weise
neuronale Netzwerke.
Neuronale Monolayer-Kulturen in vitro werden zunehmend als Werkzeuge anerkannt,
um die funktionellen Antworten von neuronalen Netzwerken auf Substanzen
zu untersuchen; sie füllen so die Lücke zwischen High-Throughput-Ansätzen,
Genomik und Proteomik auf der einen Seite und Tiermodellen auf der anderen.
Neuronale Netzwerke in vitro sind klein genug, um für genaue Untersuchungen
vollständig zugänglich zu sein. Sie sind aber auch gleichzeitig
Systeme, die komplex genug sind, um eine Vorhersagekraft für Wirkung
von Medikamenten auf das Herkunftsgewebe zu haben.
Neuronale Netzwerke, die mit unseren Bedingungen kultiviert werden, bleiben
gewebespezifisch und behalten die pharmakologische, gewebespezifische
Rezeptorausstattung des Herkunftsgewebes. Wir haben Substanzen untersucht,
die an exzitatorischen, inhibitorischen und modulierenden Rezeptorsystemen
angreifen. Des weiteren sind wir in der Lage, Daten über den physiologischen
Wirkmechanismus der Substanz zu liefern, die am Rezeptorsystem für
Glutamat (NMDA, AMPA, Kainate), Acetylcholin (nikotinisch und muskarinisch),
Serotonin, Dopamin, Noradrenalin, GABA-A, GABA-B, Glycin und verschiedenen
anderen wirkt.
Anders als Systeme mit neuronalen Stammzellen oder Vorläuferzellen
entwickeln sich Primärkulturen aus einem Gemisch von verschiedenen
Neuronentypen und Gliazellen. Gliazellen haben wichtige unterstützende
Funktionen für den Metabolismus und für die Versorgung der Nervenzellen
mit Ionen und Nährstoffen. Lange Zeit wurde den Gliazellen nur eine
passive Rolle zur Unterstützung der Neuronen zugeschrieben. Im letzten
Jahrzehnt konnte eine Vielzahl von Studien allerdings nachweisen, dass
die Glia ein notwendiger mitwirkender Faktor beim Dialog von Neuronen
an der Synapse ist. Gliazellen stellen zusätzliche Ziele für
neuronale Signale dar und reagieren auf die synaptische Freisetzung von
Neurotransmittern und Neuromodulatoren. Das Konzept einer "Drei-Parteien-Synapse"
(prä-, postsynaptisch und Glia) ist mittlerweile akzeptiert, um den
Beitrag der Glia zur synaptischen Transmission und zur Informationsverarbeitung
im ZNS zu erklären.
Nervenzellen und Gliazellen teilen sich Elemente der extrazellulären
Matrix, die sowohl von Nervenzellen als auch Astrocyten erzeugt wird.
Gliazellen spielen eine wichtige Rolle bei den Interaktionen, bei neuronaler
Aktivität, Wachstum und axonalem Wachstum. Zellkultursysteme, die
spezifisch für Gehirnregionen sind, sind bei uns für Rückenmark
und frontalen Cortex etabliert. Die Gewebe werden, je nach Hirnregion,
von embryonalen NMRI-Mäuse zwischen Tag 14 und 17.5 entnommen. Nach
Ethylesterbetäubung werden die Mäuse, gemäß Deutschem
Tierschutzgesetz, durch zervikale Dislokation getötet. Die verschiedenen
Zellkulturen für die speziellen Hirnregionen werden dann entsprechend
unseren etablierten Zellkulturverfahren dissoziiert, ausgesät und
kultiviert. Nachdem sich die für die Gehirnregion spezifischen und
stabilen Signalmuster der elektrischen Aktivität entwickelt haben,
gewährleistet die Co-Kultur mit Gliazellen die Langzeitstabilität.
In vitro beginnt die Aktivität etwa 3-4 Tage in Form von zufälligen
Salven von Aktionspotenzialen, die sich nach 4 Wochen in Kultur zu einem
synchronisierten Aktivitätsmuster stabilisieren, das ein koordiniertes
Hauptmuster (frontaler Cortex) bzw. ein koordiniertes Hauptmuster mit
mehreren koordinierten Untermustern (in Abhängigkeit von der Burststärke)
mit Interburstspiken aufzeigt (Rückenmark). Solche Netzwerke bleiben
für mehr als sechs Monate spontan aktiv und pharmakologisch beeinflussbar
und zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit über die Kulturen. Das ermöglicht
sowohl akute als auch langzeitige Behandlungen. Das Fehlen einer Blut-Hirn-Schranke
in diesem experimentellen System spiegelt die Situation einer Entzündung
mit einer durchlässigen Blut-Hirn-Schranke - "leaky barriers"
- wieder.
Spike Train Analyse
Neuronale Netzwerkkulturen auf Mikroelektroden-Arrays sind ein hervorragendes
Werkzeug zum Studium der Funktionsweise von neuronalen Netzwerken, wie
sie im zentralen Nervensystem (ZNS) beim Menschen oder Tieren auftreten.
Da mit dieser Technik gleichzeitig die Aktionspotenziale mehrerer Nervenzellen
jeweils einzeln über einen längeren Zeitraum beobachtet werden
können, sind auf diese Weise neue Einblicke in die Funktionalität
eines solchen Netzwerkes möglich. Es werden während eines Experimentes
also die Zeitpunkte der Aktionspotenziale ("Spikes") für
jeweils eine Nervenzelle in der Zeit aufgezeichnet (der so genannte "Spike
Train"). Paralle können maximal bis zu 256 Nervenzellen eines
neuronalen Netzwerkes aufgenommen werden.
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Substanz-spezifische Aktivitätsmuster
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Charakteristische Substanz-spezifische Aktivitätsmuster
von 15 parallel aufgezeichneten Neuronen des Rückenmarks
für eine Zeitdauer von 30s.
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Zur Auswertung der Aktivitätsmuster von neuronalen Netzwerken werden
Verfahren der Spike Train Analyse angewendet. Mithilfe des Programme NEX
(Plexon, Inc., Dallas,. TX) und PATTERN EXPERT squid (NeuroProof GmbH)
können wir mehr als 200 verschiedene Spike Train Parameter berechnen.
Für eine Episode können auf der Basis dieser 200 Spike Train
Merkmale die durch Substanzen hervorgerufenen Änderungen der Aktivitätsmuster
für jede Substanz eindeutig wieder erkannt, sprich klassifiziert,
werden. Damit wird die Reproduzierbarkeit der beobachteten Aktivitätsmuster
nachgewiesen.
Merkmalskategorien
Wir beschreiben mit der Spike Train Analyse fünf grundsätzliche
Kategorien: die allgemeine Aktivität, die allgemeine Aktivität
in den Bursts, die Synchronität, die Oszillationen sowie die innere
Struktur der Bursts, die Burst-Form.
Allgemeine Aktivität
Die Spikerate, also die Anzahl der Spikes pro Zeiteinheit, für eine
Nervenzelle oder die mittlere Spikerate für mehrere Nervenzellen,
ist eines der wichtigsten Merkmale überhaupt. Die mittlere Spikerate
korreliert zumeist sehr gut mit der zugegebenen Konzentration einer Substanz.
Mit einem Kurven Fitting kann man die EC10, (Effektive Konzentration 10%),
EC50 den EC90 und den Hill Koeffizienten nH berechnen.
Die Dosis Wirkungs Kurve für die mittlere Spikerate kann einen biphasischen
Verlauf zeigen, der ein deutlicher Hinweis auf den Effekt mehrerer Wirkungsmechanismen
der zugegebenen Substanz ist.
Allgemeine Aktivität in den Bursts
Spike Trains von Aktionspotenzialen sind zeitlich deutlich in Ruhe- und
Aktivitätsphasen, sog. Bursts, strukturiert. Die mittlere Anzahl
der Spikes pro Zeiteinheit im Burst beschreibt die Stärke der Bursts,
ein weiterer Parameter in dieser Kategorie ist der Anteil der Spikes die
in Bursts enthalten sind. Letzterer Parameter beschreibt die Möglichkeit,
wie deutlich die Bursts abgegrenzt werden können. In diesem Parameter
unterscheiden sich zum Beispiel sehr schön vom frontalen Kortex stammende
Kulturen, (im Gegensatz) zu Kulturen aus dem Rückenmark.
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Synchronität
Die Synchronität der Aktivitätsmuster in neuronalen Netzwerken
ist Gegenstand intensiver Untersuchungen. Der Einfluss von Substanzen
auf die Synchronität ist ein sehr wichtiges charakteristisches Phänomen.
Mit neuronalen Netzwerken auf Mikroelektroden Arrays können diese
Effekte in idealer Weise studiert werden. Da die Aktionspotenziale über
mehrere Nervenzellen jeweils einzeln über eine längere Zeit
mit hoher Präzision, im Mikrosekundenbereich, aufgezeichnet werden
können, ist somit die Analyse der Synchronität in höchster
Auflösung in Zeit und pro Nervenzelle möglich. Wir können
damit, wie es bisher nicht möglich war, die Synchronität in
unterschiedlichen Auflösungsskalen analysieren und beschreiben.
Oszillationen
Aktionspotenziale treten in deutlich periodischen Mustern auf. Die Regelmäßigkeit
dieser periodischen Muster ist ein weiteres Charakteristikum für
die Wirkung neuroaktiver Substanzen.
Burst-Struktur
In unseren Untersuchungen ist die Burststruktur, das heißt die Anzahl
und zeitliche Verteilung der Spikes in einem Burst, ein ganz wesentliches
Merkmal für die Beschreibung der von Substanzen herbeigeführten
Änderungen der Aktivitätsmuster.
Profiling
Mit Mustererkennungsmethoden suchen wir die für einzelne Substanzen
oder Gruppen von Substanzen charakteristischen Spike Train Merkmale heraus,
mit denen man Dosis-Wirkungs-Kurven mit einer hohen Signifikanz und Aussagekraft
erhält.
(Vorlesungen und Seminare)