Beschreibung der Arbeitsgruppe

Prof. Dr. Dietmar Schiffmann

Institut für Zellbiologie und Biosystemtechnik

Zelluläre Pathophysiologie

D-18051 Rostock, Universitätsplatz 2
Tel.: 0381 498 1923/1917
Fax: 0381 498 1918
Email: dietmar.schiffmann@biologie.uni-rostock.de

Institut für Zelltechnologie e.V.
Forschungszentrum Biosystemtechnik
Friedrich-Barnewitz-Str.4
D-18119 Rostock-Warnemünde
Tel.: 0381 54345 650/681/670
Fax: 0381 54345 651

Diese Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit Fragen der Umwelttoxikologie. Es werden In-Vitro-Zellkulturverfahren, Fluoreszenzmikroskopie sowie molekularbiologische Methoden eingesetzt, um Verfahren zu entwickeln, die eine genauere Charakterisierung von Fremdstoffen bezüglich ihrer Wirkmechanismen ermöglichen sollen. Ferner sollen auf der Basis der gewonnenen Erkenntnisse neue "Screening-Systeme" zur raschen und sicheren Erfassung toxischer Wirkungspotentiale entwickelt werden.
 
 

I. Ein Tätigkeitsfeld der Arbeitsgruppe stellt die Entwicklung und Optimierung von Verfahren zur Analyse gentoxischer Wirkungen von Umweltchemikalien dar. Seit einer Reihe von Jahren arbeiten wir mit Syrischen Hamsterembryofibroblasten (SHE). Wir haben einen Mikrokerntest mit diesen Zellen etabliert und eine Prävalidierung mit zahlreichen Kanzerogenen und Nichtkanzerogenen durchgeführt. Dabei wurden auch nicht direkt DNA-schädigende Kanzerogene mit einbezogen. Es ergab sich eine Übereinstimmung von 85 % mit der Kanzerogenität und von 95 % mit Ergebnissen des SHE-Transformationstests. Diese Daten haben uns veranlaßt, eine Reihe weiterer Stoffe zu untersuchen. Insgesamt wurden bisher 75 Substanzen in diesem Test untersucht; die gewonnenen Ergebnisse haben den prädiktiven Wert des SHE-Mikrokerntests bestätigt. Zur Zeit arbeiten wir an der Entwicklung einer vollautomatisierten Testauswertung mittels Bildanalyse.

Der Test selbst wird durch mehrere Verfahren ergänzt, die Einblicke in prinzipielle Wirkmechanismen gentoxischer Stoffe ermöglichen. Neben dem Kinetochor-Nachweis (CREST-Antiserum) wird auch Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH) zur Unterscheidung aneugener und clastogener Wirkungen eingesetzt. Ferner findet die sogenannte Tandem-Labeling Technik (an humanen Fibroblasten) Anwendung. Dazu werden DNA-Sonden eingesetzt, welche spezifisch mit der großen Heterochromatinregion in der perizentrischen Region bestimmter Chromosomen (1q12 bzw. 9q12) reagieren. Diese Regionen sind hochempfindlich für clastogene Wirkungen. Gleichzeitig werden spezielle a-Satellite-DNA-Sonden appliziert, die gegen schmale, nicht auf clastogene Wirkungen reagierende Regionen nahe der Heterochromatinregion gerichtet sind. Aus der jeweiligen Fluoreszenzverteilung in den Interphasekernen (Lage, Zusammensetzung und Anzahl der Signale) wird dann erkennbar, welche Art von Chromosomenveränderung (numerisch oder strukturell) eingetreten ist. Diese Untersuchungen erfolgen in Kooperation mit Prof. David Eastmond, University of California Riverside.

Weitere ergänzende Daten liefert die Supravitale UV-Mikroskopie. Diese Methode wurde in Zusammenarbeit mit Prof. U. DeBoni, University of Toronto, entwickelt. Dabei wird die DNA in lebenden SHE- und Humanzellen mit Fluoreszenzfarbstoff markiert und UV-Licht sehr niedriger Intensität eingestrahlt. Die resultierenden Signale werden mittels Restlichtverstärkung und Kontrastverstärkung zu einem auswertbaren Bild zusammengesetzt. Diese Methode erlaubt die Erfassung aberranter Lokalisationen fluoreszenzmarkierter Chromatinelemente in den verschiedenen Stadien der Mitose. Das Verfahren ermöglicht erstmals eine exakte Analyse der Entstehung von Mitosestörungen und deren Zuordnung zu den einzelnen Phasen derartiger Vorgänge. Da in den einzelnen Mitosestadien völlig unterschiedliche Elemente (Tubulinstrukturen, Kinetochore etc.) betroffen sein können, wird es nunmehr möglich, auch Einblicke in mechanistische Zusammenhänge zu gewinnen.

Wir haben eine Kombination der genannten Verfahren z.B. zur Charakterisierung gentoxischer Wirkungen von Mineralfasern eingesetzt. Dabei stellte sich heraus, daß sowohl Asbest- als auch Keramikfasern Chromosomenfehlverteilungen und Chromosomenbrüche in der Mitose von SHE-Zellen induzieren, ohne direkt mit dem Spindelapparat zu interagieren. Dieses typische Wirkungsspektrum kann nun zur Identifizierung anderer gentoxischer Fasern genutzt werden.
 
 

II. Das zweite Arbeitsgebiet, welches im Rahmen des DFG-Innovationskollegs "Komplexe und zelluläre Sensorsysteme" bearbeitet wird, ist die Charakterisierung endogener und exogener neurotoxischer Wirkungen. In diesem Projekt werden Veränderungen der elektrischen Aktivität biologischer neuronaler Netzwerke (Maus, Cortex bzw. embryonales Rückenmark; Aktionspotentialmuster) quantitativ und qualitativ erfaßt. Diese Arbeiten werden in Kooperation mit Prof. G. Gross, University of North Texas, Denton, USA, der dieses System entwickelt hat, durchgeführt. Zur Zeit werden auch Techniken zur Erfassung weiterer nervenzellphysiologischer Parameter (Patch Clamping, Messungen von Ionenkonzentrationen, pH-Wert und Membranpotential) etabliert. Da die Kommunikation in multizellulären neuronalen Netzwerken die wichtigste Funktion des Nervensystems darstellt, sind Störungen bzw. Veränderungen der Entwicklung und Funktion des Nervensystems mit einem elektrisch aktiven Netzwerk, das zudem über alle wesentlichen Transmitter-Rezeptoren verfügt, besser und empfindlicher erfaßbar, als in Kulturen von Einzelzellen. Dies wird anhand unserer neurotoxikologischen Untersuchungen mit Schwermetallen, Organometallen und Pestiziden deutlich, die alle, je nach Wirkmechanismus, charakteristische Veränderungen der Netzwerkaktivität induzieren. Dabei treten deutliche Beeinflussungen der elektrischen Aktivität bereits bei 1/100 bis 1/10 der zytotoxischen Konzentrationen in Erscheinung. Dieses System soll in der Zukunft für die Charakterisierung neurotoxisch wirksamer Substanzen nutzbar gemacht werden. Ferner soll es Anwendung bei der Prüfung neuroaktiver Stoffe auf pharmakologische Wirksamkeit finden. Diesbezügliche Arbeiten werden bereits durchgeführt.
 
 

III. Ein weiteres Forschungsthema meiner Arbeitsgruppe ist die molekulargenetische Analyse humaner maligner Tumoren. Im Rahmen dieser Arbeiten haben wir z.B. Melanome unterschiedlichen Malignitätsgrades sowie deren Vorstufen mit Hilfe einer neu entwickelten Kombination von RFLP-PCR, SSCP und DGGE auf Präsenz von Punktmutationen im N-ras-, p53- und p16-Gen geprüft. Ziel dieser Untersuchungen war es, festzustellen, wieviele dieser Mutationen direkt mit UV-Einwirkung (z.B. durch Pyrimidindimere) in Zusammenhang stehen bzw. welche anderen Mutationstypen in Melanomen präsent sind. Die so gewonnenen DNA-Sequenzierungsdaten wurden unter Einbeziehung bereits bekannter Daten zu Mutationsspektren verarbeitet. Dabei ergab sich folgendes Bild: Die häufigste Läsion war eine Transversion (CAA nach AAA) am Codon 61 des N-ras-Gens. Diese Veränderung wurde in 31 % aller hochmalignen, nodulären Melanome beobachtet. Die weniger malignen Formen (z. B. oberflächlich spreitende Melanome) wiesen diese Mutation, die höchstwahrscheinlich durch Interaktion von UV-Strahlung mit Photosensitizern aufgrund von Radikalbildung entsteht, nicht auf. In den Tumorsuppressorgenen p16 und p53 waren zwar in DNA aus Primärtumoren kaum UV-spezifische Mutationen (z.B. CC nach TT) zu beobachten; in daraus abgeleiteten Zellinien traten diese jedoch deutlich in Erscheinung. Es erscheint daher möglich, daß bestimmte Subpopulationen im Primärtumor diese Mutationen tragen und dadurch später in Kultur einen Selektionsvorteil erlangen. Die Bedeutung derartiger Zellen für die maligne Progression von Melanomen wird nun experimentell überprüft. Im Zuge dieser Arbeiten wurde auch eine verbesserte Methode der allelspezifischen Restriktionsanalyse zur Detektion von Punktmutationen in Tumoren entwickelt, deren Anteil an neoplastischen Zellen gering ist. Ferner wurde zur schnellen und zuverlässigen Klonierung von PCR-Produkten ein neuer, modifizierter T-Vektor konstruiert. Hierzu wurde in den für die Sequenzierung besonders geeigneten M13-Vektor eine EcoRV-Restriction-Site einkloniert.

IV. Ein weiteres, neues Projekt mit umwelttoxikologischer Thematik ist auf die Erfassung und Charakterisierung östrogener Wirkungen umweltrelevanter Stoffe in Säugerzellen ausgerichtet. Es wird als Doppelprojekt mit Herrn Prof. G. Vollmer, Technische Universität Dresden, durchgeführt. Während er spezifische Veränderungen der Genexpression in Rattenendometriumkarzinomzellen untersucht, besteht die Aufgabe meiner Arbeitsgruppe darin, von Gen- und Transkriptionsregulation unabhängige Prozesse zu untersuchen, welche ebenfalls in Zusammenhang mit östrogener Wirkung diskutiert werden (z. B. intrazellulärer pH-Wert und Ionenverteilung, Einflüsse auf das Zytoskelett). Dieses Projekt soll dazu beitragen, eine Basis für ein Testsystem für Umwelöstrogene zu schaffen. Damit soll sowohl ein Beitrag zur Risikoabschätzung als auch zur Identifizierung weiterer Substanzen mit östrogener Wirkung geleistet werden.
 
 

Zur Zeit besteht meine Arbeitsgruppe aus den Wissenschaftler/innen Dr. Thilo Papp (Molekulargenetik), Dr. Simone Stüwe und Frieda Dürr (Neuronale Netzwerke / Umweltöstrogene), dem Doktoranden Florian Schiffmann (nicht verwandt mit dem Arbeitsgruppenleiter), dem Diplomanden Holger Schipper sowie den technischen Assistentinnen Heidi Pemsel und Heinke Wobith.